دانلود پایان نامه

rapae

شکل ۳-۴ ضلع شفاف قفس استفاده شده برای پرورش زنبور Diaeretiella rapae

3-2-1- هم‌سن‌سازی زنبورها
به منظور بدست‌آوردن زنبورهای هم‌سن با توجه به تعداد زنبور مورد نیاز جهت انجام هر یک از آزمایش‌های زیست‌سنجی تعدادی شته‌های پارازیته‌شده توسط قلم مو از داخل قفس‌ها برداشته شده و به اتاقک رشد منتقل شدند. این شته‌های مومیائی به مدت ۲۴ ساعت در داخل اتاقک رشد با درجه‌حرارت ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۵±۷۰ درصد و دوره‌ی نوری ۱۶ ساعت روشنائی و ۸ ساعت تاریکی قرار گفتند. پس از گذشت ۲۴ ساعت زنبورهای تفریخ شده بعنوان زنبورهای همسن توسط آسپیراتور۷۹ از داخل پتری برداشته شده و بطور جداگانه تا انجام آزمایش‌های زیست‌سنجی نگهداری شدند.

۳-۳- تهیه‌ی عصاره‌های گیاهی
نمونه های گیاهی در این پژوهش با توجه به بررسی منابع مختلف مبنی بر داشتن اثر حشره کشی جمع آوری گردیدند. نمونه ها بصورت خشک تهیه شده و جهت عصاره گیری از گیاهان ابتدا ۲۰ گرم از هر نمونه گیاه خشک شده با آسیاب برقی پودر و در یخچال با دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد (شکل ۳-۵).
چون ماده موثر موجود در گیاه ممکن است قطبی، غیر قطبی و یا حد واسط باشد جهت انجام این آزمایش از ۳ حلال متانول(قطبی)، هگزان(غیرقطبی) و استون(حدواسط) استفاده گردید.
برای عصاره گیری ۲۰ گرم از گیاه پودر شده درون ظرف شیشه ای درب دار قرار گرفته و ۱۰۰ میلی لیتر حلال روی آن ریخته شد و دور آن با فویل پوشانده شد تا از تابش نور به آن جلوگیری شود. سپس داخل ظرف یک مگنت انداخته شد و به مدت یک ساعت روی همزن۸۰ با سرعت ۵۰۰ دور در دقیقه قرار داده شد (شکل ۳-۶).
این مخلوط عصاره و تفاله به مدت ۲۴ ساعت در یخچال با دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری و پس از خارج کردن از یخچال یک کاغذ صافی را در قیف شیشه ای گذاشته و قیف را در ارلن ۵۰۰ میلی لیتری قرار داده و عصاره را داخل قیف روی کاغذ صافی ریخته تا عصاره از تفاله جدا شود.
پس از استحصال عصاره رویی مجدداً ۲۰ میلی لیتر حلال را روی تفاله ریخته و بمدت یک ساعت روی همزن با سرعت قبلی گذاشته شد و مانند مرحله قبل عصاره آن استخراج شد. عصاره استخراج شده توسط دستگاه تقطیر در خلا در دمای ۴۰ درجه سانتیگراد و سرعت ۱۰۰ دور در دقیقه تغلیظ گشت بطوریکه در پایان حجم نهایی عصاره تغلیظ شده به ۳۰ میلی لیتر رسید (شکل ۳-۷).
عصاره های تهیه شده در شیشه های درب دار تیره رنگ داخل یخچال نگهداری و روی آنها برچسب زده شد و تاریخ عصاره گیری ثبت گردید.

شکل ۳-۵ آسیاب برقی استفاده شده برای پودر کردن گیاهان روناس و کلپوره

شکل ۳-۶ مگنستایر مورد استفاده جهت عصاره گیری

شکل ۳-۷ دستگاه روتاری مورد استفاده برای عصاره گیری

۳-۴- آزمایش‌های زیست‌سنجی
۳-۴-۱- تعیین حلال‌مناسب
آزمایش های مقدماتی به منظور بررسی پتانسیل حشره کشی عصاره هر یک از گیاهان بصورت آزمایش فاکتوریل (فاکتور اول گونه های گیاهی فاکتور دوم نوع حلال) در قالب طرح کاملاً تصادفی با ۳ تکرار روی شته B. brassicae و زنبور D. rapae انجام شد.
هر واحد آزمایشی شامل یک پتری دیش با قطر هشت سانتی متر و عمق یک سانتیمتر بود که کف آن کاغذ صافی قرار گرفته بود. برای انجام آزمایش محلولی با غلظت ۳۰۰ میکرولیتر بر میلی لیتر از عصاره های روناس و کلپوره استحصال شد و توسط برج سم پاش روی کاغذ صافی اسپری شد. در تیمار شاهد هم بسته به نوع حلال، از حلال مورد نظر استفاده گردید و روی کاغذ صافی اسپری شد. پتری ها به مدت دو ساعت در دمای اتاق نگهداری شدند تا حلال بخار شود. پس از آن درب پتری ها بسته شده و درون هر پتری ۲۰ عدد زنبور هم سن ماده قرار داده شد. پتری ها در انکوباتور در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد و رطوبت نسبی ۷۰ درصد قرار داده شدند و تعداد حشرات تلف شده پس از ۳۶ ساعت شمارش گردیدند.در طول این مدت آب و عسل در اختیار زنبورها قرار گرفت. لازم به ذکر است برای انجام این آزمایش برای شته B. brassicae بجای کاغذ صافی از اسپری کردن عصاره روی گیاه استفاده گردید و پس از بخار شدن حلال شته های هم سن بوسیله قلم موی ریز با دقت بر روی گیاهان منتقل شدند.

۳-۴-۲- تعیین غلظت مناسب
در این مرحله‌ دزهای مختلفی از هر عصاره به صورت جداگانه روی حشرات با ۳ تکرار مورد بررسی قرار گرفتند برای انجام آزمایش‌های این قسمت از پتری ‌هایی با قطر هشت سانتی‌متر و عمق یک سانتیمتر که کف‌آن‌ها با کاغذ صافی پوشانده شده بود استفاده گردید ، به منظور انجام آزمایش‌های زیست‌سنجی برای شته از روش کاربرد غیر مستقیم استفاده گردید. به منظور استفاده از این روش از یک دستگاه برج سم‌پاش دستی که تولید یک باقیمانده‌ی ۱۰±۱۶۹ می‌کرد استفاده گردید (شکل ۳-۹). این دستگاه بدین جهت انتخاب شد که برای تولید یک اسپری کالیبره شده طراحی شده است. و در واقع شرایطی بسیار نزدیک به شرایط مزرعه‌ای را نیز فراهم می‌سازد. شته‌ها در معرض باقی‌مانده‌ی عصاره‌ها بر روی برگ‌های کلزا قرار گرفتند. عصاره‌ها همانطور که ذکر شد توسط برج سم‌پاش روی برگ‌های گیاهان کلزا که جدا شده بودند در مرحله‌ی دو برگی پاشیده شد و اسپری حلال بعنوان شاهد استفاده گردید. پس از وارد کردن شته‌ها روی گیاهان کلزا ریشه این گیاهان توسط پنبه‌ی خیس‌پوشانده شد تا در طی انجام آزمایشات این مرحله شادابی گیاه حفظ شود. در این آزمایش‌ها داخل هر پتری‌دیش ۱۰ شته روی برگ‌های رهاسازی گردید و برای هر غلظت چه
ار تکرار استفاده شد. پس از گذشت ۲۴ ساعت حشرات تلف شده شمارش گردیدند. مرگ و میر بصورت درصد حشرات مرده نسبت به تعداد اولیه در هر تکرار محسابه گردید و برای اصلاح درصد مرگ و میر از فرمول ابوت (۱۹۲۵) به شرح زیر استفاده شد.

T=درصد مرگ و میر در تیمار
C=درصد مرگ و میر در شاهد

از آن‌جائی که در این آزمون غلظت هایی که صفر درصد و صد درصد تلفات را ایجاد می‌کند مناسب نیست، اولین دزی که بیش از ۱۰ درصد تلفات را ایجاد کرد بعنوان پائین‌ترین دز و دزی که حدود ۸۰ درصد تلفات را ایجاد نمود بعنوان بالاترین دز مؤثر برای انجام آزمایش‌های اصلی انتخاب شدند. دزهای بین آن‌ها از طریق قرار دادن در فرمول زیر بصورت فاصله‌ی لگاریتمی بدست آمدند. در مجموع پنج غلظت از هر عصاره به همراه یک شاهد استفاده شد.

A و E به ترتیب بالاترین و پائین‌ترین غلظت‌ها، B و C و D غلظت‌های بین آن‌ها هستند. همچنین a مقدار ثابت برای تمام غلظت‌ها و n برابر با تعداد غلظت‌ها می‌باشد. گیاهان کلزا پس از اسپری شدن توسط دستگاه برج ‌سم‌پاش تقریباً به صورت یک‌ساعت و قبل از ورود شته‌ها در دمای اتاق نگهداری شدند تا اینکه حلال بطور کامل از سطح برگ ها بخار شود. شته‌ها توسط قلم‌ موی بسیار ریز و با دقت کامل روی گیاهان کلزا منتقل شدند و تا زمان شمارش در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۵±۷۰ درصد نگهداری شدند. آزمایشات زیست‌سنجی در این مرحله روی زنبورهای پارازیتوئید به همین شکل انجام گردید. بدین صورت که عصاره‌ها در غلظت‌های معین توسط دستگاه برج‌سم‌پاش در پتری‌دیش‌های پوشیده شده با کاغذ صافی پاشش‌شدند و پس از بخار شدن حلال زنبورهای همسن توسط آسپیراتور۸۱ (شکل۳-۱۰) جدا سازی شده و داخل این پتری دیش‌ها قرار گرفتند. در هنگام استفاده از آسپیراتور دقت شد که به آرامی زنبورها منتقل شوند تا از هر گونه آسیب‌زدن به آن‌ها جلوگیری به عمل آید، در صورتیکه مشاهده می‌شد یکی از زنبورها صدمه دیده باشد توسط یک زنبور سالم جایگزین گردید. پتری‌دیش‌ها تا ز مان شمارش افراد مرده در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد ، رطوبت‌نسبی ۵±۷۰ درصد قرار گرفتند. ظروف پتری مورد استفاده دارای قطر هشت سانتی‌متر و عمق‌ یک سانتی‌متر بودند و برای ایجاد تهویه‌ی کافی سوراخی روی درب پتری‌ها ایجاد شده بود که با توری ‌مش ‌ریز پوشانده شده بود تا در ضمن از فرار حشرات نیز جلوگیری گردد (شکل ۳-۱۱).
پس از گذشت ۲۴ ساعت از شروع آزمایش میزان تلفات در تیمارهای مختلف یادداشت شده و بوسیله‌ی نرم افزار SAS مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفته و دزهای کشنده محاسبه گردید.

شکل ۳-۸ دستگاه Potter spray tower مورد استفاده در آزمایشهای زیست سنجی

شکل ۳-۹ آسپیراتور مورد استفاده جهت انتقال زنبورهای D. rapae

شکل ۳-۱۰ پتری دیش های استفاده شده در آزمایش های زیست سنجی

۳-۴-۳- زیست‌سنجی حشرات با عصاره روناس
جهت انجام آزمایش‌ها از عصاره‌ی متانولی روناس استفاده شد. پس از انجام تست مقدمانی و بدست‌آوردن فاصله دزها برای انجام تست اصلی از پنج غلظت به همراه شاهد استفاده گردید و در هر غلظت چهار تکرار و در هر تکرار ۱۵ عدد حشره‌ی هم سن استفاده شدند این حشرات همگی در اتاقک رشد (شکل ۳-۱۲) با شرایط دما و رطوبت ذکر شده در قبل به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند و پس از اتمام دوره در هر تکرار تلفات شمارش گردیده و ثبت شدند.

۳-۴-۴- زیست‌سنجی حشرات با عصاره‌ی کلپوره
جهت انجام آزمایش‌ها از عصاره‌ی متانولی کلپوره استفاده شد. پس از انجام تست مقدمانی و بدست‌آوردن فاصله دزها برای انجام تست اصلی از پنج غلظت به همراه شاهد استفاده گردید و در هر غلظت چهار تکرار و در هر تکرار ۱۵ عدد حشره‌ی هم سن استفاده شدند این حشرات همگی در اتاقک رشد با شرایط با شرایط دما و رطوبت ذکر شده در قبل به مدت ۲۴ ساعت قرار گرفتند (شکل ۳-۱۲) و پس از اتمام دوره در هر تکرار تلفات شمارش گردیده و ثبت شدند.

شکل ۳-۱۱ اتاقک رشد مورد استفاده در آزمایشهای زیست سنجی

۳-۵- بررسی دز زیر کشنده‌ی عصاره‌ها
در این آزمایش‌ها برای بررسی دز زیر کشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره روی رفتار و بیولوژی زنبور پازازتیوئید D.Rapae از غلظت LC25 هر کدام از عصاره‌ها استفاده گردید و تأثیر هر کدام از عصاره‌ها روی رفتار میزبان‌یابی، طول‌عمر ، درصد پارازیتیسم، درصد تفریخ و نسبت‌جنسی نسل بوجود آمده از زنبورهای تیمار شده بررسی گردید.

۳-۵-۱- باروری زنبورها:
قبل از انجام آزمایش‌های این قسمت زنبورهای ماده به مدت ۲۴ تا ۳۶ ساعت در کنار زنبورهای نر نگهداری شدند تا اطمینان حاصل شود که عمل جفت‌گیری انجام شده است. پس از اتمام این مرحله زنبورهای ماده بطور جداگانه در لوله‌های آزمایش ‌به مدت ۱۲ ساعت قبل از انجام آزمایش نگه‌داری شدند زنبورها در طی این مدت بوسیله‌ی آب‌مقطر و عسل تغذیه می‌شدند. عسل روی نوارهای بسیار باریک کاغذ بصورت قطرات بسیار ریز که با نوک‌ سوزن قرار داده شده بود در اختیار زنبورها قرار می‌گرفت و آب ‌مقطر نیز بوسیله‌ی پنبه‌ی نم در اختیار زنبورها قرار گرفت. کاغذ حاوی قطرات ریز آب عسل ۵۰ درصد طوری تا زده شد تا از گیر افتادن زنبورها حتی‌الامکان جلوگیری شود. در پایان این دوره ز
نبورهای ماده‌ی تغذیه کرده که تا کنون با میزبان خود تماسی نداشتند وارد پتری‌های حاوی کاغذ صافی تیمار شده توسط غلظت‌های زیرکشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره و نیز شاهد شدند ( از حلال به عنوان شاهد استفاده گردید).
در این قسمت حشرات به مدت ۱۲ ساعت در معرض دز زیر کشنده قرار گرفتند. در این آزمایش پنج تکرار برای هر تیمار که شامل ۲۰ زنبور ماده‌ی هم سن جفت‌گیری کرده بود وجود داشت. پس از اتمام ۱۲ ساعت پتری‌‌ها به دقت باز شده و زنبورهای زنده مانده به آرامی توسط آسپیراتور وارد لوله‌های آزمایش که محتوی آب و عسل برای تغذیه‌ی آن‌ها بودند ‌،شدند. و تا زمان انجام آزمایش در اتاقک رشد با دمای ۱±۲۵ درجه‌ی سانتی‌گراد و رطوبت نسبی ۵±۷۰ درصد قرار گرفتند. به منظور انجام آزمایش‌های باروری ۱۰ زنبور ماده زنده مانده از هر کدام از تیمارها بصورت تصادفی انتخاب شده و هر کدام بطور جداگانه وارد پتری‌‌هائی شدند که هر کدام حاوی ۵۰ شته‌ی بالغ بر روی گیاهان کلزا بودند. پتری‌ها روی درب خودشان دارای یک سوراخ تقریباً ۵/۲ سانتی‌متری بودند که توسط توری با مش‌ریز پوشانیده شده بود تا عمل تهویه‌ به خوبی انجام شود. هر کدام از زنبورها به مدت ۴۸ ساعت در کنار شته‌ها نگهداری شدند پس از ۴۸ ساعت زنبورها حذف گردیده و پتری‌‌ها بر چسب‌خورده و به مدت ۲۰ روز در نگهداری شدند. در پایان دوره تعداد شته‌های پارازیته شده، درصد تفریخ و نسبت‌جنسی نسل تازه‌ی بوجود آمده برای هر تیمار یادداشت گردید.

۳-۵-۲- طول عمر زنبورهای بالغ
زنبورهای بالغ طبق پروسه‌ی ذکر شده در مرحله‌ی قبل در معرض دز زیرکشنده‌ی عصاره‌های روناس و کلپوره قرارگرفتند. پس از گذشت یک ساعت زنبورهای تیمار شده بصورت مجزا وارد پتر‌ی‌‌های حاوی آب عسل شدند و در اتاقک رشد قرار گرفتند. پارازاتیوئیدها بصورت روزانه مورد بازدید قرار گرفتند و این کار تا زمان مرگ تمام زنبورها ادامه یافت. در طی این مدت در صورت لزوم آب و عسل جدید در اختیار زنبورها قرار گرفت. در این مرحله ۲۱ تکرار برای عصاره روناس و ۲۳ تکرار برای عصاره ی کلپوره و شاهد مورد استفاده قرار گرفت.

۳-۵-۳- بررسی رفتار میزبان‌یابی زنبورهای ماده
زنبورهای پارازاتیوئید ماده که در معرض دز زیرکشنده‌ی هر کدام از عصاره ها طبق پروسه‌ی ذکر شده قرار گرفته بودند، بصورت جداگانه و توسط آسپیراتور وارد لوله های آزمایش با قطر ۱۰ میلی‌متر و طول ۶ سانتی‌متر شدند و به مدت ۱۲ ساعت تا قبل از انجام آزمایش بویائیسنجی نگهداری شدند. پاسخ‌های رفتاری زنبورهای D. Rapae نسبت به گیاهان آلوده به شته‌های مومی‌کلم در یک دستگاه بویائی‌سنج با دو لوله‌ی باز به طول ۵۷ سانتیمتر و ابعاد ۵ در ۵ سانتیمتر مورد بررسی قرار گرفت. در هر کدام از لوله‌ها جریان هوا توسط فن‌های تعبیه شده در انتهای لوله‌ها به قسمت وسطی بویائی‌سنج جریان پیدا می‌کرد. بین فن‌های به کار رفته در این دستگاه و قسمت میانی دستگاه (محل رهاسازی) محفظه‌ای تعبیه شده بود که به منظور قرار دادن گیاهان کلزای آلوده به شته به کار می‌رفت و به منظور عدم تداخل نور در انجام آزمایش‌های بویائی سنجی، همه‌ی آزمایش‌ها در تاریکی انجام گردید و برای تامین نور مورد نیاز برای ثبت مشاهدات از یک منبع نوری قرمز رنگ که در بالای دستگاه تعبیه شده بود استفاده گردید (شکل ۳-۱۳).
در هر کدام از آزمایش‌ها فقط در یکی از لوله‌های دستگاه بویائی‌سنج گیاهان کلزای آلوده به شته مومی‌کلم B.brassicae ،‌قرار می‌گرفت در حالیکه لوله‌ی دیگر که هوای خالص در آن جریان داشت بعنوان

این فایل ها تست های آزمون آزمایشی کارشناسی ارشد انتشارات سنجش و دانش می باشد که با پاسخ های کاملا” تشریحی ارائه می شود. شما می توانید از منوی جستجو (بالای سایت سمت چپ ) تست های دروس دیگر را پیدا کرده و رایگان دانلود کنید